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Notre objectif est de comprendre le mécanisme moléculaire des machines biomoléculaires en utilisant une approche biophysique intégrée, combinant la biochimie, la thermodynamique, la cinétique, la biologie structurelle et la dynamique moléculaire.

Axes de recherche

Contacts : Eric Ennifar, Isabelle Lebars.

Collaborateurs : Joao Marques (Federal University of Minas Gerais, Brazil & CNRS UPR 9022 IBMC), Karim Majzoub (IGMM Montpellier, CNRS UMR 5535), Bertrand Vileno (Institut de Chimie de Strasbourg, CNRS UMR 7177)

Les virus du Zika (ZIKV) et de la Dengue (DENV) appartenant à la famille des Flavivirus sont transmis par piqûres de moustiques infectés. Avec environ 390 millions d’infections répertoriées chaque année, DENV est considéré comme l’un des virus les plus critiques par l’Organisation Mondiale de la santé. Concernant le ZIKV, la première émergence significative a été observée en 2007 dans les îles du Pacifique Sud et plus tard au Brésil, se répandant rapidement sur le continent Américain en 2015-2016. Actuellement, aucun traitement efficace ou vaccin n’existent contre ces virus. Dans la mesure où DENV et ZIKV se répandent chez des hôtes vertébrés et invertébrés, une stratégie efficace pour bloquer la transmission virale et la diffusion du virus serait de cibler des étapes spécifiques de la réplication virale. Le développement de nouvelles stratégies antivirales nécessite une compréhension précise des étapes clefs du cycle viral. Les virus à ARN comportent souvent, au sein de leur génome, des régions structurées non codantes multifonctionnelles. Les régions non traduites 5’- et 3’- (UTR) des génomes de DENV et ZIKV sont hautement conservées et sont impliquées dans la réplication virale.

Organisation du génome viral

Les interactions ARN-proteines jouent un rôle crucial dans ce cycle de réplication et dans le détournement de la machinerie cellulaire de l’hôte. Afin de développer de nouvelles stratégies antivirales, nous avons pour objectifs de : (i) décrypter les interactions ARN-protéines impliquées dans le cycle de réplication et (ii) identifier et caractériser les facteurs chez le moustique qui interagissent avec l’ARN génomique de ces virus. Dans ce but, nous utilisons des approches biophysiques intégrées incluant la microcalorimétrie isothermale (ITC), la technologie « switchSENSE » basée sur l’utilisation de puces à ADN, la spectrométrie UV-visible, la Spectrométrie de Masse (MS), la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE, en collaboration), la Cryo-Microscopie Electronique (Cryo-EM), la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et la Cristallographie aux rayons X.

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Projets passés

Contact : Isabelle LEBARS.

Collaboratrice: Dr Anne-Catherine Dock-Bregeon (LBI2M, Roscoff, CNRS UMR 8227).

Le petit ARN nucléaire 7SK (7SKsnRNA) joue un rôle majeur dans la régulation de l’activité de l’ARN polymérase II en séquestrant et en inhibant le facteur d’élongation P-TEFb dans le complexe ribonucléoprotéique 7SKsnRNP. Ce processus est médié par la protéine HEXIM. P-TEFb, hétérodimère composé de la cycline T1 et de la kinase CDK9, est un facteur cellulaire indispensable recruté par la protéine virale Tat afin d’assurer la réplication de l’ARN viral dans le cycle d’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1). En déplaçant la protéine HEXIM de la partie 5’ de l’ARN 7SK (Hairpin I, HPI), la protéine virale Tat capture P-TEFb, le libérant du complexe 7SKsnRNP et permettant ainsi l’activation de la transcription.

Représentation schématique de la régulation P-TEFb par le complexe 7SKsnRNP

Cette tige-boucle HPI, comprenant le motif « signature » de l’ARN 7SK, a fait l’objet de 3 études structurales indépendantes visant à identifier les facteurs structuraux à l’origine de la reconnaissance par HEXIM et Tat. Ces deux protéines contiennent des motifs hautement similaires « ARM » (Arginine Rich Motif) de liaison à l’ARN. De manière intéressante, 4 structures distinctes ont été obtenues dans différentes conditions (pH, sels). Nous avons utilisé la Titration Calorimétrique Isotherme (ITC) afin de déterminer les signatures thermodynamiques de l’interaction des domaines ARM de Tat et HEXIM avec l’ARN 7SK, dans différentes conditions. Nous avons ainsi montré que, bien que Tat-ARM et HEXIM-ARM soient hautement similaires, leurs signatures thermodynamiques dans le cadre de la liaison à HP1 diffèrent, indiquant des mécanismes de liaison distincts.

Publication :

Brillet K, Martinez-Zapien D, Bec G, Ennifar E, Dock-Bregeon A C, Lebars I. Different views of the dynamic landscape covered by the 5′-hairpin of the 7SK small nuclear RNA. RNA (2020), 26 (9):1184-1197.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32430362/

Financement :

La transcriptase inverse (RT) du VIH-1 est une enzyme clé dans le cycle de vie du virus, qui convertit l’ARN génomique viral en ADN proviral. Elle est également une pierre angulaire de la thérapie anti-VIH, puisque la moitié des composés individuels inhibant la réplication virale ciblent le site actif de la polymérase de la RT. Les inhibiteurs RT du VIH-1 sont divisés en inhibiteurs RT analogues aux nucléosides (INTI), qui entrent en concurrence avec le substrat nucléosidique naturel, et en inhibiteurs RT non nucléosidiques (INNTI), qui se lient à une poche hydrophobe adjacente au site actif de la polymérase. Nous avons effectué des études biophysiques et structurelles sur deux nouveaux inhibiteurs de la RT : un analogue de DABO qui est apparu comme l’un des inhibiteurs de la RT les plus actifs signalés jusqu’à présent (Ec50 = 25 pM), et DAVP-1, un inhibiteur de la RT non nucléotidique avec un mécanisme d’action inhabituel. La structure cristalline de la RT du VIH-1 liée au DAVP-1 a révélé un nouveau site de liaison proche du site catalytique de la RT polymérase.

Nous avons également abordé le mécanisme d’action de la RT et des inhibiteurs non nucléosidiques de la RT (INNTI) par calorimétrie à titrage isotherme (ITC). En utilisant une nouvelle approche de CTI incrémentielle, une dissection thermodynamique étape par étape de l’activité de polymérisation RT a montré que la majeure partie de la force motrice pour la synthèse de l’ADN est fournie par la liaison initiale du dNTP. De manière surprenante, les données thermodynamiques et cinétiques ont conduit à une réinterprétation du mécanisme d’inhibition des INNTI. La liaison des INNTI aux complexes RT/ADN préformés est entravée par une barrière cinétique et les INNTI interagissent principalement avec la RT libre. Une fois formés, les complexes RT/INNTI se lient à l’ADN soit dans une orientation apparemment compatible avec la polymérase, soit forment des complexes à haute affinité en cul-de-sac, les deux complexes RT/INNTI/ADN étant incapables de se lier au substrat nucléotidique entrant.

Publications sélectionnées :

Les riboswitches sont des éléments non codants en amont ou en aval des ARN messagers qui, en se liant à un ligand spécifique, régulent l’initiation de la transcription ou de la traduction dans les bactéries, ou l’épissage alternatif dans les plantes et les champignons. Nous avons étudié les domaines aptamères des riboswitches thiamine pyrophosphate (TPP) du thiC et du thiM chez E. coli, qui régulent respectivement la transcription et la traduction, et celui du THIC chez A. thaliana. Pour tous, nous avons établi un mécanisme d’ajustement induit avec une liaison initiale lâche du TPP (caractérisée par les paramètres kon et koff) transformée ensuite en liaison serrée après un changement de conformation de l’ARN (caractérisé par les paramètres kF et kU). En utilisant notre approche kinITC, nous avons obtenu la dépendance en température de tous les paramètres cinétiques et thermodynamiques pour les riboswitches bactériens. Les résultats impliquent une régulation cinétique, qui nécessite que l’ARN polymérase s’arrête après la synthèse de l’aptamère du riboswitch. Un modèle quantitatif de régulation a mis en évidence la façon dont le temps de pause doit être lié aux taux cinétiques de liaison initiale du TPP pour obtenir un interrupteur ON/OFF dans la plage de concentrations correcte du TPP. Nous avons vérifié l’existence de ces pauses et la prédiction du modèle sur leur durée. Le riboswitch d’A. thaliana, au contraire, est sous contrôle thermodynamique classique et a montré une dépendance considérable de sa cinétique de pliage par rapport à la température, ce qui suggère qu’il pourrait également agir comme un thermocapteur. Notre analyse a également montré que les riboswitches à régulation cinétique réagissent plus fortement aux variations de concentration de leur ligand que les riboswitches à régulation thermodynamique. Cela rationalise l’intérêt de la régulation cinétique

Publications sélectionnées :

Le site d’initiation de la dimérisation du VIH-1 (DIS) est une épingle à cheveux conservée dans le 5′ UTR de l’ARN génomique. L’altération du DIS affecte la dimérisation de l’ARN, l’emballage et la transcription inverse, et réduit l’infectivité virale. La boucle DIS initie la dimérisation du génome en formant un complexe boucle-boucle et est ensuite stabilisée, vraisemblablement sous une forme duplex étendue par interaction avec la protéine nucléocapside NCp7 virale. Nous avons résolu les structures cristallines de la boucle à baiser DIS et du duplex étendu. Nos structures ont révélé des similitudes avec le site A de l’ARN ribosomique 16S de la bactérie, qui est la cible des antibiotiques aminoglycosidiques. En conséquence, nous avons montré que les aminoglycosides se lient au VIH-1 DIS. Étonnamment, l’affinité de ces molécules pour la boucle à baiser du DIS est plus élevée que pour leur cible naturelle dans les ribosomes bactériens. Leur liaison stabilise fortement le complexe boucle-boucle et empêche sa conversion en forme duplex, même en présence de NCp7. Nous avons également résolu de nombreuses structures radiologiques à haute résolution du complexe DIS kissing-loop et du duplex étendu lié à plusieurs aminoglycosides. Cependant, l’identification des forces motrices moléculaires importantes pour la liaison DIS/aminoglycoside n’a pas pu être réalisée en considérant uniquement les données structurelles, ce qui souligne l’importance de la collecte de données thermodynamiques et structurelles pour une compréhension complète du processus de reconnaissance moléculaire.

En utilisant la microcalorimétrie ITC, la thermodynamique des aminoglycosides se liant aux formes duplex et kissing-loop du VIH-1 DIS a été étudiée dans une série de conditions. Avec les données structurelles fournies par les structures cristallines à haute résolution, nous avons pu établir les bases de la spécificité de la reconnaissance des médicaments/ARN et permettre de discriminer entre des sites de liaison spécifiques et des sites secondaires concurrents potentiels. Nous avons également pu montrer que la liaison du médicament au complexe DIS kissing-loop inhibe la conversion assistée par NCp7 dans la forme duplex étendue. En utilisant toutes ces données, nous pourrions rationnellement concevoir un conjugué aminoglycoside qui se lie spécifiquement à l’ARN DIS du VIH-1. Nos résultats montrent qu’il est possible de cibler le dimère du VIH-1 DIS avant et après la maturation de l’ARN assistée par le NCp7 avec la même molécule.

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Publications sélectionnées :

à compléter

Publications sélectionnées :

Nous avons résolu une structure d’ARN 27-nt à une résolution subatomique (0,57 Å). À cette résolution, la plupart des atomes d’hydrogène de l’ARN, ainsi que certains hydrogènes du solvant aqueux, sont visibles. En outre, à une telle résolution ultime, le modèle d’atomes sphériques indépendants ne peut pas être appliqué et les densités de déformation sont visibles. Par conséquent, nous affinons actuellement la structure en utilisant des méthodes d’affinage multipolaires.

Image sur le thème 8-1 - Ennifar

Développement d’une nouvelle approche par étapes : la méthode RIP. Nous avions signalé qu’une des principales causes d’échec de la technique MAD avec les bromo- ou iodo-uridines était due au clivage de l’atome d’halogène induit par les rayons X. En considérant le clivage de ces diffuseurs anomaux comme générant un “natif” à partir d’un cristal “dérivé”, nous avons pu compléter la perte progressive du signal anomal utilisé dans le phasage MAD par ce signal concomitant de type MIR. Nous avons maintenant renforcé la méthode en montrant comment surveiller l’étendue du clivage à tout moment pendant la collecte des données.

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Une alternative pour la mise en phase MAD consiste à utiliser de l’ARN séléné (résistance accrue aux radiations). Cependant, la modification de l’ARN en remplaçant un ou plusieurs groupes 2′-OH par un ou plusieurs groupes 2′-SeCH3 est chimiquement lourde et coûteuse. Nous avons donc développé une stratégie basée sur le criblage préliminaire de la cristallisation de l’ARN modifié en 2′-OCH3, avant le remplacement des groupes 2′-OCH3 par leurs homologues 2′-SeCH3.

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Nous avons mis en œuvre des développements méthodologiques majeurs en matière de calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Tout d’abord, les ITC qui fournissent des informations cinétiques similaires aux données habituellement obtenues par résonance plasmonique de surface, ainsi que des informations thermodynamiques habituellement récupérées par les ITC. En partenariat avec Software for Science Development, notre stratégie kinITC a été mise en œuvre dans le logiciel de traitement de données AFFINIMETER ITC

Deuxièmement, l’ITC incrémentiel permet une dissection étape par étape des réactions successives dans les machines biomoléculaires. Cette approche a été utilisée avec succès pour découvrir le mécanisme d’action de la transcriptase inverse du VIH-1 et le mécanisme d’inhibition des inhibiteurs de la transcriptase inverse du VIH-1 utilisés en clinique.

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Les pinces coulissantes multimériques pour l’ADN (également appelées anneaux β) confèrent une grande processivité aux polymérases réplicatives de l’ADN. Ce sont également des centres moléculaires sur lesquels de nombreuses protéines impliquées dans le métabolisme de l’ADN interagissent en se liant, via une séquence peptidique conservée, dans une poche universellement conservée (figure).

Anneau de processivité d'E. coli
Structure d’un co-crystal de l’anneau de processivité β de E.coli et du peptide de liaison (jaune) de l’ADN polymérase IV apparentée. Un seul monomère de l’anneau est lié.
Interaction peptidique dans la poche bipartite d'E. coli
Détail de l’interaction peptidique dans la poche bipartite à une résolution de 1,65 Å (Burnouf, JMB, 2004 ; Wolff, J Med Chem, 2011).

Chez les bactéries, la poche d’interaction est une nouvelle cible potentielle pour le développement de nouveaux composés antibactériens, qui sont nécessaires de toute urgence pour contrôler et surmonter la résistance bactérienne croissante aux antibiotiques.

Nous utilisons une approche basée sur la structure pour concevoir des peptides qui se lient dans la poche d’interaction avec une grande affinité, entrent en compétition avec les polymérases de l’ADN et déclenchent la mort cellulaire. Ce projet est mené grâce à une stratégie multidisciplinaire et intégrée résultant d’une étroite collaboration entre sept laboratoires différents, combinant ainsi la synthèse chimique, la modélisation moléculaire, les analyses structurelles, biophysiques et biochimiques et l’évaluation in vivo de l’efficacité des ligands pour inhiber la croissance bactérienne et les processus infectieux.

Dans le cadre de cette collaboration, notre tâche consiste à produire les anneaux β de différentes origines bactériennes et à analyser l’interaction des peptides nouvellement conçus avec ces anneaux, en utilisant des techniques biophysiques telles que l’ITC, la cristallographie à rayons X et la spectrométrie de masse.

Bibliographie :

Collaborations :

Prof Annick Dejaegere (IGBMC, Illkirch, France), Dr Gilles Guichard (IECB, Pessac, France), Dr Gaetan Mislin (ESBS, Illkirch, France), Dr Vincent Oliéric ( SLS, Villigen, Suisse), Prof Jean Marc Reichardt (IBMC, Strasbourg, France), Dr Jérôme Wagner (ESBS, Illkirch, France).

Financements :

Inserm, AstraZeneca

Brevets :

  • Structure cristalline de la protéine du facteur de processivité de l’ADN polymérase et un ligand et cet usage. EP 1639509, 29 mars 2003 – WO2004EP06942 20040625. Burnouf D, Wagner J, Dumas P, Fujii S, Fuchs R, Olieric V.
  • Compounds binding to the bacterial beta ring. EP11162733.7, dépôt EPO le 15 avril 2011, délivré le 7 septembre 2012. Burnouf D, Dejaegere A, Guichard G, Oliéric V, Wagner J.

Selection de publications

Simonetti A, Guca E, Bochler A, Kuhn L, Hashem Y. Structural Insights Into the Mammalian Late-Stage Initiation Complexes. Cell Rep (2020), 31 (1):107497. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32268096?dopt=Abstract

Brillet K, Martinez-Zapien D, Bec G, Ennifar E, Dock-Bregeon A C, Lebars I. Different views of the dynamic landscape covered by the 5′-hairpin of the 7SK small nuclear RNA. RNA (2020), 26 (9):1184-1197.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32430362/

Auffinger P, Ennifar E, D’Ascenzo L. Deflating the RNA Mg 2+ bubble. Stereochemistry to the rescue! RNA (2020), 27 (3):243-252. https://doi.org/10.1261/rna.076067.120

D’Ascenzo L, Vicens Q, Auffinger P. Identification of receptors for UNCG and GNRA Z-turns and their occurrence in rRNA. Nucleic Acids Res (2018), 46(15):7989-7997. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29986118?dopt=Abstract

Bec G, Meyer B, Gerard MA, Steger J, Fauster K, Wolff P, Burnouf B, Micura R, Dumas P, Ennifar E. Thermodynamics of HIV-1 reverse transcriptase in action elucidates the mechanism of action of non-nucleoside inhibitors. J Am Chem Soc (2013);135(26):9743-52. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23742167/

Ennifar E, Aslam MW, Strasser P, Hoffmann G, Dumas P, van Delft FL. Structure-guided discovery of a novel aminoglycoside conjugate targeting HIV-1 RNA viral genomeACS Chem Biol (2013);8(11):2509-17. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24015986/

Burnouf D Y, Ennifar E, Guedich S, Puffer B, Hoffmann G, Bec G, Disdier F, Baltzinger M, Dumas P. kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by Isothermal Titration Calorimetry. J Am Chem Soc (2012), 134(1):559-565.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22126339

Freisz S, Bec G, Radi M, Wolff P, Crespan E, Angeli L, Dumas P, Maga G, Botta M, Ennifar E. Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase bound to a non-nucleoside inhibitor with a novel mechanism of action. Angew Chem (2010), 49(10):1805-8. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20135654/

Ennifar E, Paillart J C, Bodlenner A, Walter P, Weibel J M, Aubertin A M, Pale P, Dumas P, Marquet R. Targeting the dimerization initiation site of HIV-1 RNA with aminoglycosides: from crystal to cell. Nucleic Acids Research (2006), 34(8):2328-39. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16679451/

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