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Plateaux techniques

Plusieurs systèmes chromatographiques complets, biocompatibles avec détection à longueur d’onde réglable.

Contacts : Guillaume Bec et Karl Brillet

Les méthodes non invasives de diffusion de la lumière fournissent des informations sur la taille et l’homogénéité des populations de particules en solution. Le coefficient de diffusion moyen en translation, le rayon hydrodynamique et la polydispersité d’une population de particules peuvent être déterminés en mode dynamique. La masse moyenne des particules et le second coefficient viriel caractérisant les interactions entre les particules peuvent être déterminés en mode statique. Les applications comprennent la détection d’agrégats et le titrage de macromolécules biologiques à l’aide de ligands.

Contact : Philippe BENAS

Principes

Les analyses de diffusion dynamique de la lumière (DLS) enregistrent les fluctuations de l’intensité de la lumière diffusée dues au mouvement brownien. Un corrélateur génère une fonction d’autocorrélation qui est ensuite déconvoluée dans une distribution de taille de particules d’intensité. Un coefficient de diffusion translationnelle (Dt) peut être extrait lorsque l’échantillon est une population unique de particules identiques. L’écart-type du Dt renseigne sur la polydispersité de l’échantillon. Un rayon hydrodynamique peut être dérivé de Dt en supposant que les particules sont des sphères dures. L’extrapolation à la concentration zéro (D0) élimine la contribution des interactions (voir par exemple Lorber et al. 2012, Biochem Mol Biol Educ 40, 372-82). Les mesures peuvent être effectuées à n’importe quelle température entre 5°C et 50°C avec des cellules appropriées.

Dans la diffusion de la lumière statique (SLS), l’intensité de la lumière diffusée est fonction de la masse et de la concentration des particules. La masse moyenne des particules dans un échantillon homogène peut être dérivée de mesures effectuées à différentes concentrations.

Comment cela fonctionne-t-il ?

L’échantillon est contenu dans une cuvette. Il peut être récupéré pour des analyses ultérieures.

Exigences expérimentales

Les gros agrégats qui diffusent la lumière beaucoup plus que les petites particules doivent être éliminés soit par chromatographie sur colonne d’exclusion de taille, soit par ultracentrifugation. La filtration n’est pas recommandée pour les macromolécules biologiques.
Les volumes et les concentrations des échantillons varient en fonction de la sensibilité de l’instrument et de la taille des particules.
Dans les DLS, le coefficient de diffusion doit être corrigé en fonction de la viscosité absolue (dynamique) et de l’indice de réfraction du solvant. En SLS, l’augmentation de l’indice de réfraction des particules et la concentration précise des particules doivent être connues.

Des équipements supplémentaires sont disponibles pour déterminer les propriétés du solvant. Il comprend :

  • un micro-viscosimètre Anton Paar AMVn pour mesurer la viscosité cinématique,
  • un pycnomètre en verre de 5 ml pour la détermination de la densité, et
  • un réfractomètre d’Abbe pour la mesure des indices de réfraction.

Envoyez vos demandes de renseignements sur les rendez-vous et les prix à Philippe BENAS.

L’ITC (Isothermal Titration Calorimetry) est la Roll-Royce pour la mesure des interactions biomoléculaires. L’ITC détermine simultanément tous les paramètres de liaison (n, K, ΔH et ΔS) dans une seule expérience – des informations qui ne peuvent être obtenues par aucune autre méthode.
Contact : Eric Ennifar et Karl Brillet

Réservations pour les personnes extérieures : contact Karl BRILLET

La technologie switchSENSE permet principalement de mesurer les interaction entre  biomolécules grâce aux cinétiques d’association et dissociation.

D’autres paramètres biologiques importants peuvent être explorés comme le rayon hydrodynamique, les changements de conformation, activité enzymatique…

La technologie repose sur l’immobilisation d’un ligand à l’extrémité d’un double brin d’acide nucléique qui oscille sous l’effet d’un courant électrique alternatif.

Couplée à une technique microfluidique, cette approche permet de travailler avec de faibles quantité de matériel biologique (50 pmoles en moyenne) et une très large gamme de poids moléculaire (quelques kDa à plusieurs MDa).

Equipements :

Robot de cristallisation en nanogouttes (quelques dizaines de µL pour un criblage de 96 conditions différentes, en 2 minutes), systèmes de visualisation automatisés (acquisition rapide des essais de cristallisation), loupes binoculaires disponibles à plusieurs températures.

Contacts : Guillaume Bec et Karl Brillet

Contact : Philippe Wolff

https://ibmc.cnrs.fr/laboratoire/spectrometrie-de-masse/equipes/analyse-de-larn-par-spectrometrie-de-masse/

Séquenceur permettant la détection d’ADNc fluorescents.

  • Équipement : ABI 3130xI Genetic Analyser (Applied Biosystems)
  • Cette plateforme permet une détection à haut débit pour :

– cartographier une molécule d’ARN afin d’en étudier la structure.

– réaliser une empreinte de la fixation de protéines ou de toute autre molécule sur un ARN.

Principe de la technique :

– L’ARN est modifié par une digestion enzymatique ou par modification chimique (réactif SHAPE, du DMS, de l’EDC …)

– La modification est détectée grâce à une réaction de transcription inverse à partir d’un Primer Fluorescent.

Fluorophores utilisés :
VIC (560 nm)
NED (580 nm)

Pour plus d’informations sur la préparation de vos échantillons ou la réalisation d’un run, contacter Valérie Vivet-Boudou.

Description du SHAPE (= Selective 2’Hydroxyl Acylation Analysed by Primer Extension)

Exemple de la détermination de la structure par SHAPE

Comment récupérer les données après l’exécution = SÉQUENCEUR DE DONNÉES DE SAUVEGARDE SUR LE SERVEUR IBMC

Contact : Valérie VIVET-BOUDOU

Équipement :

Désintégrateur de type “french press” pour grand volumes de cellules.

Équipement :

Hottes à flux laminaire, étuves à CO2, microscope à contraste de phase.
Contact : Jean-Christophe Paillart

Laboratoire de microbiologie de classe de confinement 2, permettant la manipulation de micro-organisme appartenant au groupe 2. Exemple : Staphyloccocus aureus, Shigella sp.

Formation obligatoire avant manipulation dans le L2 assurée par Anne-Catherine HELFER-LE FOLL.

Équipement :

PSM de type II (= poste de sécurité microbiologique comprenant un système d’aspiration d’air qui maintient la surface de travail en dépression permanente), incubateurs, centrifugeuse, entrée sécurisée par porte à code.
Contact : Anne-Catherine HELFER-LE FOLL

PowerPoint de la formation : « How to manipulate in L2 lab »