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Nos analyses
La protéomique est principalement l’analyse des protéines composant un mélange complexe. En spectrométrie de masse “bottom up”, ce sont les peptides issus d’une digestion enzymatique des protéines qui sont analysés. Ces dernières années, la tendance s’est inversée : la digestion à partir de gels SDS-PAGE a laissé la place aux digestions de protéines directement en solution.
Notre plateforme s’est spécialisée dans les analyses de co-immunoprécipitation ou co-IP.
L’immunoprécipitation (IP) est une technique utilisée pour isoler une protéine d’intérêt d’un lysat cellulaire pour la caractérisation des protéines cibles et pour étudier les interactions protéines-protéines.
Le processus nécessite un anticorps, qui a une forte affinité et spécificité pour la protéine cible. Cet anticorps est mélangé à l’échantillon, ce qui permet aux complexes anticorps-cibles de se former. Des billes magnétiques qui reconnaissent ces complexes sont alors utilisées pour aller “pêcher” et isoler les protéines cibles ainsi que toute autre protéine liées.
Lorsqu’il n’y a pas d’anticorps disponible, la protéine cible peut être génétiquement modifiée à l’aide d’une étiquette peptidique (tags HA, Flag, myc ou GFP pour les plus courants). Ce sera alors cette étiquette qui sera ciblée lors de l’IP.
La plateforme réalise les deux types d’IP en fonction de la disponibilité en anticorps. Les complexes protéiques sur les billes peuvent être digérés pour une identifications des protéines par spectrométrie de masse.
Une des conditions clés pour une analyse par immunoprécipitation réussie est l’utilisation de contrôles d’aspécificité efficaces.
L’approche protéomique différentielle vise à mettre en évidence les protéines dont l’expression est modulée entre deux conditions d’analyse. Ce peut être des traitements différents sur un même échantillon, des temps différents… L’identification des protéines différentiellement exprimées permet l’établissement d’une vision pertinente des mécanismes physiopathologiques impliqués.
L’analyse Label-Free regroupe différentes méthodes de quantification relative de protéines sans marquage isotopique. Contrairement aux méthodes de quantification basées sur un marquage isotopique, les échantillons à comparer sont analysés séparément. Le biais technique est alors gommé par les réplicats biologiques (n=3 au minimum) et le nombre de conditions à comparer n’est plus limité mais requiert la plus grande stabilité de performances LC et MS. Les approches Label-Free sont basées soit sur l’aire des peptides détectés (XIC), soit sur le nombre de spectres MS/MS acquis pour chaque peptide (spectral count).
L’analyse label-free par comptage de spectres est la plus utilisée à la plateforme.
