Structure, dynamique et ciblage des machines biomoléculaires

La calorimétrie par titrage isotherme (ITC) est l’étalon-or pour la mesure des interactions biomoléculaires. L’ITC détermine simultanément tous les paramètres de liaison (n, K, ΔH et ΔS) dans une seule expérience – des informations qui ne peuvent être obtenues par aucune autre méthode.

Lorsque les substances se lient, de la chaleur est soit générée, soit absorbée. L’ITC est une technique thermodynamique qui mesure directement la chaleur libérée ou absorbée lors d’un événement de liaison biomoléculaire. La mesure de cette chaleur permet de déterminer avec précision les constantes de liaison (KB), la stoechiométrie de la réaction (n), l’enthalpie (ΔH) et l’entropie (ΔS), fournissant ainsi un profil thermodynamique complet de l’interaction moléculaire en une seule expérience. Parce que l’ITC va au-delà des affinités de liaison et peut élucider le mécanisme de l’interaction moléculaire, elle est devenue la méthode de choix pour caractériser les interactions biomoléculaires.

Les applications comprennent :

Études sur la liaison

Tous les processus cellulaires nécessitent une liaison spécifique et une reconnaissance moléculaire entre les biomolécules. La connaissance de ces interactions est importante pour comprendre comment les protéines, les acides nucléiques et les lipides fonctionnent dans les systèmes biologiques. Des progrès rapides ont été réalisés en biologie structurelle et en reliant la structure à la fonction et au mécanisme biochimiques. Cependant, la connaissance de la structure seule ne permet pas de prédire avec précision la fonction et l’activité biologique. La caractérisation complète de toute interaction de liaison nécessite une quantification de l’affinité, du nombre de sites de liaison et de la thermodynamique.

Les données thermodynamiques, en particulier l’enthalpie (ΔH) et l’entropie (ΔS), révèlent les forces qui régissent la formation et le mécanisme d’action complexes. La thermodynamique fournit des informations sur les changements de conformation, la liaison hydrogène, les interactions hydrophobes et les interactions charge-charge. Ces informations peuvent être utilisées pour décrire la fonction et le mécanisme au niveau moléculaire.

Études de liaison avec la calorimétrie par titrage isotherme (ITC)

La calorimétrie par titrage isotherme (ITC) est un outil analytique puissant qui mesure l’affinité de liaison et la thermodynamique entre deux biomolécules quelconques. L’ITC est considérée comme le test “étalon-or” pour la liaison, et présente de nombreux avantages :

• Essai universel – mesure directement le changement de chaleur associé à la liaison
• Sans label – utilise des matériaux indigènes
• Une véritable technique en solution
• Nécessite un développement minimal du test
• Ne présente aucune limitation de poids moléculaire
• Non-optique
• Polyvalent, il peut être utilisé avec n’importe quelle biomolécule – protéines, acides nucléiques, médicaments à petites molécules, lipides, etc.
• Peut être utilisé avec un large éventail de tampons biologiques, de forces ioniques, de pH

Dans une seule expérience de l’ITC, on peut déterminer :

• L’affinité de liaison – Kd
• Mesurer directement de sub-millimolaire à nanomolaire
• Peut étendre la gamme d’affinité au picomolaire en utilisant la méthode compétitive de l’ITC
• Le nombre de sites de liaison
• Des sites de liaison multiples et différents
• L’enthalpie (ΔH) et l’entropie (ΔS) de la liaison

L’ITC est essentiel dans l’étude des relations entre structure et activité des sondes multiples (SAR) car il peut détecter des contributions que les méthodes par affinité seulement peuvent manquer. Par exemple, l’affinité mesurée par ces méthodes peut être similaire pour une protéine de type sauvage et mutante se liant à un médicament, mais l’ITC peut révéler des différences dans ΔH et ΔS qui peuvent décrire le mécanisme d’action de la liaison. Ces informations peuvent valider la modélisation in-silico. L’ITC est également couramment utilisé pour valider d’autres tests de liaison.

L’ITC devient un outil important dans la caractérisation des interactions entre les médicaments et les cibles, et peut être utilisé à différents stades de la découverte et du développement des médicaments. L’ITC est polyvalent et peut être utilisé pour caractériser la liaison entre deux molécules quelconques.

Cinétique des enzymes

Les réactions catalytiques enzymatiques sont au cœur de toutes les voies biologiques. Une grande partie de la recherche biochimique est consacrée à la caractérisation de la fonction, de l’activité et de la structure des enzymes, ainsi qu’à la manière dont les enzymes sont inhibées et activées. La caractérisation des enzymes est également essentielle à la découverte de médicaments, car de nombreuses cibles de médicaments sont des enzymes. Il s’agit notamment des kinases et des protéases.

La calorimétrie par titrage isotherme (ITC) est bien établie dans l’étude de l’affinité des interactions moléculaires, et devient maintenant un outil courant dans l’étude de la cinétique des enzymes. La force de cette technique réside dans la nature universelle de l’ITC. Les analyses enzymatiques traditionnelles utilisent une sonde pour surveiller soit l’épuisement du substrat, soit la formation du produit. Ces sondes sont dépendantes du système et doivent être optimisées pour chaque réaction dans des conditions spécifiques. De plus, il peut être nécessaire de modifier le substrat, ce qui pourrait interférer avec la réaction de catalyse. Pour les méthodes optiques, les conditions expérimentales peuvent affecter le système de détection, empêchant des mesures précises. Cela signifie qu’avec les méthodes d’analyse traditionnelles, de nombreuses enzymes ne disposent pas de tests pratiques.

L’ITC utilise la chaleur comme sonde, et puisque chaque réaction génère ou absorbe de la chaleur, il n’est pas nécessaire de développer une longue méthode à chaque fois qu’une nouvelle enzyme est testée. L’ITC mesure directement le changement de chaleur au fur et à mesure de la catalyse, qui est proportionnel à la vitesse de la réaction. Todd et Gomez (2001) ont montré que les Km et kcat des expériences ITC concordent favorablement avec les méthodes traditionnelles de cinétique enzymatique, et peuvent être utilisés avec toutes les classes d’enzymes, y compris celles qui ne sont pas soumises à d’autres méthodes de dosage direct.

L’utilisation de l’ITC pour surveiller la vitesse des réactions enzymatiques est un test non destructif, sensible et direct. Des injections multiples de substrat peuvent être effectuées en une seule expérience, ce qui permet de déterminer le Km et le kcat en une seule expérience d’ITC. Avec l’ITC, il est facile de faire varier les conditions expérimentales telles que le pH et la force ionique, et on peut obtenir une analyse complète de la catalyse et de la cinétique. L’ITC fournit également de précieuses informations sur la thermodynamique des réactions enzymatiques.

Mesure des affinités de liaison étroites avec l’ITC

La gamme des constantes de liaison qui peuvent être directement mesurées avec la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) va du millimolaire au nanomolaire. Avec une liaison serrée (KB >109 M-1 ou Kd plus serrée que la nanomolaire), les titrages ITC perdent leur courbure et l’affinité ne peut être calculée avec précision (Figure1, panel A – Wiseman et al, 1989). Une méthode permettant de mesurer les KB supérieurs à 109 M-1 a été mise au point (Sigurskjold, 2000, Velazquez-Campoy et Freire, 2006). Cette méthode nécessite deux ligands : un ligand à liaison étroite (A) et un second ligand (B) qui a une affinité de liaison plus faible et se lie de manière compétitive au même site que le ligand A. Dans la première expérience ITC (figure 1, panel B), le ligand B est titré dans la solution de protéine, et le KB et ΔH sont déterminés. Dans la deuxième expérience ITC (figure 1, panel C), le ligand A est titré dans le complexe protéine-ligand B et le ligand A déplace le ligand B. En utilisant des modèles appropriés d’ajustement de courbe (Sigurskjold, 2000), la constante de liaison du ligand à liaison étroite peut être calculée. Velazquez-Campoy et al (2001) ont utilisé cette méthode pour étudier plusieurs inhibiteurs de la protéase du VIH-1.

FIGURE 1. Titrages ITC représentatifs de ligands compétitifs se liant au VIH pour la détermination du KB du ligand à liaison étroite.